应用简介

凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。通过原代分离获得的细胞具有与体内细胞相似的生物学特征，是研究生物体相关生命活动的理想材料。

原理介绍

原代细胞的分离是将人小鼠等特异模式动物的细胞从机体中取出，经睫、螫合剂(常用DTA)处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和殖的过程。原代培养是指直接从机

体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把 代至第十代以内的

培养细胞统称为原代细胞培养。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。

实验方法

一、悬浮细胞的分离方法

组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，可采用低速离心。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。

二、实体组织材料的分离方法

对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞导液，可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。其中，机械分散法的特点是简便、快速，但对组织机械损伤大，而

且细胞分散效果差，适用于处理纤维成分少的软组织。消化分离法是指把组织剪切成较小团块(或糊状)，应用酶的生化作用和非的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，

此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少星细胞群团和大量单个细胞的细胞导液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。

三、小鼠肝细胞原代培养

取肝脏 除杂物 研磨肝脏 胰酶消化 滤网去杂 细胞计数

技术总结

1、原代培养材料的选择，尽量选取繁殖能力较强的组织，如胚胎、幼小的生物体或者肿瘤组织等

2、要注意无菌操作。其操作要求应高于外科手术

3、整个取材操作要迅速，尤其孕鼠浸泡乙醇时间1min左右，不能过长，以确保胚胎细胞活性。

4、运用消化法时睫酶温度应低于37℃，浓度只需平时消化细胞浓度的一半。因为此过程不像消化培养细胞时的1~10min，而是至少20min，先消化下来的细胞在此睫酶消化液中继续消化了10min以上。所

以酶不能作用过强，否则这些细胞易被损伤而不易生存。

5、如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能黏附于瓶壁时再使之与培养液接触，匆使组织块漂浮起来。如果组织块没有黏壁，则细胞不易生长，即使生长也因没有贴在瓶壁上，从而因不能观察到而无法收

集到生长的细胞

6、原代培养操作时，也可以使用未添加血清的DMEM或PBS洗涤子官、胚胎或组织块等。

7、本实验也可以使用新生乳鼠做培养材料。此时要将乳鼠浸入75%乙醇2~3min使皮肤充分消毒，由于乳鼠原代培养污染概率更高，故应小心操作，避免污染细菌。乳鼠原代培养细胞的存活率不及胚胎细胞

培养的成功率。