应用简介

克隆形成及细胞克隆接种存活率，通过观察单细胞集落形成情况，来计算克隆形成率，了解其增殖能力。

技术原理

单个细胞在体外持续增殖6代以上时细胞数量已达60个左右，此细胞群体成为克隆或集落，大小在1.0-2.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力，各种理化

因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变，通过计数克隆形成率，可对单个细胞的增殖潜力做定量分析，了解细胞的增殖率和对生存环境的适应性。软琼脂培养或平板克隆是最常用的方法。

实验方法

1. 细胞准备阶段

• 状态调整：将目标细胞在常规培养条件下传代培养，确保细胞处于对数生长期（活力>90%）。
• 单细胞悬液制备：用胰酶消化贴壁细胞，经200目筛网过滤去除细胞团块，台盼蓝染色计数活细胞比例。

2. 梯度接种与培养

• 密度梯度设置：根据细胞增殖能力，按10、50、100、200个细胞/孔的梯度，将单细胞悬液均匀接种至6孔板（每孔含2mL完全培养基）。
• 静置培养：37℃、5% CO₂培养箱中静置培养7-14天，期间每3天更换1/2体积培养基，避免细胞过度生长。

3. 克隆观察与定量

• 克隆固定与染色：待肉眼可见克隆形成（通常>50个细胞/克隆），弃培养基后用PBS洗涤2次，4%多聚甲醛固定15分钟，0.1%结晶紫染色20分钟。
• 克隆计数与计算：流水冲洗去除多余染液，晾干后计数每孔克隆数（直径>0.5mm视为有效克隆），按公式计算克隆形成率

技术总结

1、试验成功的关键是细胞暴液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

2、细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度，否则结果的准确度会受到很大影响。

3、克隆形成率公式:克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)x ，细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量

4、一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强;二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强;正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。