应用简介

DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此DNA取方面的工作，那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。

在DNA提取过程中应做到:1、根据不同研究需要，保证结构的相应完整性;2、尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等);3、保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。下面结合不同的研究对象列出几种相应的DNA提取方法。

技术原理

原核生物的基因是连续不间隔的,直接用限制酶从DNA切取就可得到目的基因，再PCR扩增后就能得到大目的基因。

真核细胞核基因组DNA编码的基因，以及感染真核细胞的DNA病毒和反转录病毒基因组编码基因，统称真核基因，真核基因调取是指通以动物组织或细胞为模板，提取获得cDNA或qDNA，从中扩增基因或启动子等功能元件。也可将基因片段或者各功能元件片段亚克隆至各载体。

一、原核基因克隆流程（DNA水平）

核心目标：从原核生物基因组中获取并验证目的基因片段

1. 基因组DNA提取

   • 收集对数生长期原核细胞（如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌），使用CTAB法或商业化试剂盒（如TIANamp Bacteria DNA Kit）提取基因组DNA。
   • 经1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性（主条带清晰，无明显降解），Nanodrop测定浓度（OD260/280≈1.8）。

2. 目的基因PCR扩增

   • 根据目的基因序列设计特异性引物（含酶切位点及保护碱基），以基因组DNA为模板进行PCR反应：
     • 反应体系（50μL）：10×Buffer 5μL，dNTPs（2.5mM）4μL，上下游引物（10μM）各1μL，Taq酶1U，模板DNA 100ng，ddH₂O补至50μL。
     • 反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸（1kb/min），30个循环；72℃终延伸10min。
   • 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证（条带大小与预期一致），割胶回收纯化（使用胶回收试剂盒）。

3. T载体连接与转化验证

   • 将纯化的PCR产物与T载体（如pMD19-T Simple Vector）按3:1摩尔比混合，加入T4 DNA连接酶，16℃连接过夜。
   • 连接产物转化至感受态细胞（如DH5α），涂布含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养12-16h。
   • 挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，阳性克隆送测序（Sanger法），比对序列确认无突变后获得重组质粒。

二、真核基因克隆流程（RNA水平）

核心目标：从真核生物组织/细胞中获取目的基因的cDNA并验证

1. 总RNA提取与质量检测

   • 取真核细胞（如HEK293T、小鼠肝脏组织），使用TRIzol法或RNA提取试剂盒（如RNAiso Plus）提取总RNA。
   • 检测指标：1%琼脂糖凝胶电泳显示28S/18S rRNA条带清晰（比值≈2:1）；Nanodrop测定浓度（OD260/280≈2.0），确保无DNA污染（OD260/230>1.8）。

2. cDNA 链合成（反转录）

   • 以总RNA为模板，使用Oligo(dT)引物或随机引物进行反转录：
     • 反应体系（20μL）：总RNA 1μg，Oligo(dT)18引物1μL，dNTPs（10mM）1μL，RNase抑制剂0.5μL，反转录酶（如M-MLV）1μL，5×Buffer 4μL，ddH₂O补至20μL。
     • 反应条件：42℃孵育60min，70℃灭活15min，产物置于-20℃保存。

3. 目的基因PCR扩增与克隆

   • 根据目的基因cDNA序列设计特异性引物（避免基因组DNA污染，可跨内含子设计），以cDNA为模板进行PCR扩增（体系与条件同原核流程）。
   • 后续步骤（T载体连接、转化、测序验证）与原核流程一致，最终获得含真核目的基因的重组质粒。