应用简介

酶联免疫吸附实验(ELSA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点

技术原理

采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂:①固相的抗原或抗体(免疫吸附剂)②酶标记的抗原或抗体(标记物)目酶作用的底物(显色剂)测量时，抗原(抗体)先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体(抗原)与酶结合成的偶联物(标记物)，此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原(抗体)含垂成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计(酶标仪)加以测定。其方法简单，方便迅速，特异性强。

酶联免疫吸附测定（ELISA）操作步骤

1. 样本孵育与洗涤

• 加样：将待检测样本（如血清、细胞培养上清）按100μL/孔加入预包被抗体的96孔板，设置空白对照（PBS）和标准品梯度（通常5-6个浓度点）。
• 孵育：37℃恒温孵育60分钟（或4℃过夜），使样本中抗原与包被抗体充分结合。
• 洗涤：弃去孔内液体，用含0.05% Tween-20的PBS（PBST）洗涤3次，每次浸泡30秒， 在吸水纸上拍干。

2. 酶标二抗结合与洗涤

• 加酶标抗体：每孔加入100μL稀释后的HRP标记二抗（按试剂盒说明书比例稀释，通常1:1000-1:5000）。
• 孵育：37℃孵育30分钟，使二抗与抗原特异性结合。
• 洗涤：同步骤1，用PBST洗涤5次， 去除未结合的酶标抗体。

3. 底物显色与终止

• 加底物：每孔加入100μL TMB显色液，37℃避光孵育10-15分钟（根据显色强度调整时间，避免过度显色）。
• 加终止液：每孔加入50μL 2M H₂SO₄终止反应，溶液由蓝色变为黄色。

4. 结果读取与分析

• 读板：使用酶标仪在450nm波长（参考波长630nm）测定各孔吸光度（OD值）。
• 数据分析：以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线，通过回归方程计算样本中抗原的浓度。

技术总结

1、可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氣乙烯微反应板及塑料管。

2、包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是 和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。

3、对某些抗原必须进行提纯，如病毒的组织培养和鸡胚培养物以及病毒接种动物的脏器等，它们当中存在着许多非抗原的蛋白质，必须设法除去，常用梯度超速离心或亲和层析法提纯，不经提纯是不能使用的。

4、用最适稀释度抗原，包被固相载体不仅经济，而且可以克服前带现象。可通过棋盘滴定法进行测定，但用单项滴定法更为简便，其方法是将抗原进行一系列稀释包被微反应板，再用一定稀释度的阳性参考血清和阴性参考血清进行孵育后洗涤，再加酶结合物进行反应，经孵育洗涤后，加底物溶液显色，终止反应后分别测定OD值，选择OD值≥1.0的那个抗原稀释度为最适包被浓度。

5、抗原包被固相载体除浓度外，对时间、温度、PH均有关系。温度高(如37℃、45℃、或56℃)，包被时间可缩短，温度低可延长包被时间