应用简介

Co-IP主要用于检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，是IP实验的一种扩展，基于IP反应的潜力，在样品溶液中捕获和纯化主要目标(抗原等)及通过天然相互作用与靶标结合的其他的大分子。此外，还可以利用Co-IP来确定在不同条件下的蛋白质相互作用。

技术原理

免疫共沉淀是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的ProteinG或A能特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的方法。其基本原理是在细胞裂解液中加入感兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于磁珠的ProteinG或A，若细胞中存在与兴趣蛋白相结合的目的蛋白，就可以形成蛋白复合物:“目的蛋白一兴趣蛋白一抗兴趣蛋白抗体一ProteinG或A”; 通过免疫印迹实验来检测目的蛋白。

1. 标准实验步骤式（按操作时序）

免疫沉淀（IP）实验完整流程：

1. 蛋白样品准备：收集细胞或组织，通过裂解液（含蛋白酶抑制剂）破碎细胞，释放总蛋白。
2. 抗原-抗体结合：向蛋白样品中加入特异性抗体，4℃孵育过夜，使抗体与目标抗原形成免疫复合物。
3. Protein G磁珠与抗体结合：加入Protein G磁珠（或Protein A磁珠，根据抗体亚型选择），孵育后磁珠通过Fc段结合抗体，形成“磁珠-抗体-抗原”复合物。
4. 免疫沉淀分离：利用磁力架分离磁珠复合物，弃去上清液（未结合蛋白）。
5. 洗脱蛋白复合物：加入洗脱缓冲液（如低pH甘氨酸或SDS缓冲液），破坏抗体与抗原的结合，释放目标蛋白。
6. WB或质谱分析：通过Western Blot验证目标蛋白的存在，或通过质谱鉴定相互作用蛋白。

2. 技术原理导向式（按核心操作分层）

IP实验核心逻辑：

• 样品制备阶段：
  细胞裂解（释放蛋白）→ 总蛋白提取（获得可溶性样品）
• 特异性捕获阶段：
  抗体孵育（抗原识别）→ 磁珠结合（固相载体捕获）→ 沉淀分离（去除非特异性结合）
• 目标蛋白分析阶段：
  洗脱（释放目标蛋白）→ WB/质谱（定性/定量检测）

3. 符号简化流程图

�  细胞裂解（蛋白样品）→ �  抗原-抗体结合 → �  Protein G磁珠捕获                              ↓    ⚡ 免疫沉淀分离 → �  洗脱蛋白复合物 → �  WB/质谱分析

4. 实验逻辑关系描述

以“目标蛋白的特异性捕获与鉴定”为核心，形成“捕获-分离-分析”三阶流程：

• 捕获阶段：通过抗体的高特异性，从复杂蛋白混合物中“钓取”目标抗原；
• 分离阶段：利用磁珠的固相载体特性，实现免疫复合物的高效分离与洗涤；
• 分析阶段：洗脱后通过WB验证单一蛋白，或通过质谱筛选互作蛋白网络，完成从“捕获”到“功能解析”的闭环。

技术总结

1、实验样品制备方法准备:很重要!根据研究目的，检测样品可能是组织样品，也可能是细胞样品，不同样品制备流程不太相同，目的蛋白表达量也有较大差别，必须选择合适的样品和样品

制备方法

2、根据研究目的选择适合的蛋白特异性抗体:非常重要!用于Co-IP实验的抗体是针对目的蛋白的特异性抗体， 的是选择一种能识别兴趣蛋白质某个表位的抗体，且这个表位不会被任何其他蛋白质相互作用所掩盖，比普通WB抗体要求高出很多;同时，抗体特异性和灵敏性尽可能高，才有可能有干净的背景和较好的IP效果，所以必须选择 的抗体用于Co-IP实验;

3、细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂(NP-40或Triton-X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定;

4、不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂;

5、使用对照抗体:单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗;免多克隆抗体:正常兔IgG

6、确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;

7、要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;

8、确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定，