应用简介

简单来讲，CRISPR/Cas9是一种分子生物学技术，通过这种技术科研人员可以对细胞和生物体内的基因进行编辑，所调的基因编辑就是通过某种生物手段和技术，对生物体内的遗传物质进行修改。基于原核生物的获得性免疫系统研发出的CRISPR/Cas9技术只包含两种重要的成分，一种是行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，而另一种则是具有导向功能的sgRNA(singleguideRNA)。当细胞内同时表达sgRNA和Cas9蛋白时，Cas9蛋白通过与sgRNA结合，靶向到目的DNA序列上发挥DNA双链切割的功能。DNA序列被切割产生断裂后，引发细胞内部的DNA修复机制(DNA repair)。真核细胞同时存在着同源重组修复和非同源重组修复。在同源重组修复下，断裂的染色体以另一条完整的姐妹染色单体为模板进行DNA修复，而在非同源重组修复下，断裂出的DNA随机修复，引入新的碱基，使基因产生移码突变

技术原理

CRISPR/Cas9系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点处剪切双链 DNA，从而实现对基因组DNA序列进行编辑;而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的gRNA(guide RNA)，用以引导Cas9对DNA 的

定点切割

靶位点的选择要求

1、靶位点主要包括20个碱基，并且这20个碱基后面是NGG的PAM区

2、靶位点尽量选择在基因编码区的前端;

3、转化应选择对应抗性的LB平板培养基。

CRISPR-Cas9载体构建与验证完整流程：

1. 靶点生物信息学设计
   通过CRISPR设计工具（如CRISPOR、CHOPCHOP）分析目标基因序列，筛选PAM位点（5'-NGG-3'）上游20 bp的特异性靶序列，评估脱靶风险并确定 靶点。

2. sgRNA表达框构建
   合成含靶序列的互补寡核苷酸引物，经退火形成双链DNA（dsDNA），通过限制性内切酶（如BbsI）定向克隆至CRISPR/Cas9载体的sgRNA表达框（含U6启动子），构建重组质粒。

3. 阳性克隆筛选
   将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，涂布含抗生素（如氨苄青霉素）的LB平板，挑取单克隆进行菌液PCR和质粒酶切验证，筛选插入方向正确的阳性重组子。

4. 编辑效果分子验证
   提取阳性克隆质粒，通过Sanger测序确认sgRNA序列准确性；若用于细胞实验，后续需转染宿主细胞，通过PCR扩增靶位点并测序，验证Indel突变或预期编辑事件。

2. 功能模块分解式（按实验目的分层）

核心模块与技术目标：

• 靶向识别模块
  靶点预测设计 → sgRNA引物合成与退火 → 载体连接（实现Cas9-sgRNA复合物的靶向性）
• 载体筛选模块
  连接产物转化 → 抗生素选择性培养 → 阳性克隆鉴定（获得功能完整的编辑工具）
• 编辑验证模块
  菌液PCR初筛 → 测序验证（确保sgRNA序列正确性，为后续细胞实验提供可靠材料）

3. 符号简化流程图

�  靶点设计（生物信息学）→ �  sgRNA引物合成&退火 → �  载体连接  ↓    �  转化筛选（阳性克隆）→ �  PCR+测序验证（序列确认）

4. 实验逻辑关系描述

以“CRISPR-Cas9编辑工具的精准构建”为核心，形成“设计-构建-验证”三阶闭环：

• 设计阶段：通过生物信息学确保靶点的特异性与有效性，为后续编辑提供“导航坐标”；
• 构建阶段：通过分子克隆将sgRNA序列整合至表达载体，形成可直接使用的编辑工具；
• 验证阶段：通过PCR和测序双重验证，确保载体序列准确无误，避免因构建错误导致的实验失败。

技术总结

Crispr/Cas9病毒特点:

1、适用于在同一个细胞系中需要进行多个基因敲除的实验;

2、基因敲除效率比直接质粒转染更高;

3、提供多种不同荧光和抗性标记的慢病毒表达载体，更易筛选到基因敲除成功细胞;

4、接受cas9蛋白稳定表达不同细胞系定制。

Crispr/Cas9腺病毒特点:

1、可感染多种分裂期和非分裂期细胞，感染效率高、敲除效率高;

2、操作简单，容易学握;

3、基因敲除周期短，成本低;

4、适合哺乳动物不同种属不同基因的操作，适用范围广。