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- 发布日期： 2026-04-23
- 更新日期： 2026-04-23
应用简介
DNA甲基化是基因表达调控的一种重要机制，DNA甲基化检测是指利用各种方法对肿瘤细胞DNA甲基化程度进行测定。在恶性肿瘤的发展中，甲基化的状态并不是一成不变，肿瘤细胞内全基因组的低甲基化程度与疾病进展、肿瘤大小和恶性程度都有密切的关系，DNA甲基化检测对肿瘤恶性程度的判断有重要意义。
技术原理
DNA甲基化是基因表达调控的一种重要机制，DNA甲基化检测是指利用各种方法对肿瘤细胞DNA甲基化程度进行测定。在恶性肿瘤的发展中，甲基化的状态并不是一成不变，肿瘤细胞内全基因组的低甲基化程度与疾病进展、肿瘤大小和恶性程度都有密切的关系，DNA甲基化检测对肿瘤恶性程度的判断有重要意义。甲基化特异性的PCR(Methylation-specificPCR，MSP]Herman等(1996)在使用重亚硫酸盐处理的基础上新建的一种方法。该方法敏感性高，主要用于作定性研究。用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化;反之，说明被检测的位点不存在甲基化。
特点:适用范围广，能够检测特异位点是否发生甲基化。
亚硫酸氢盐测序法(BisulfitesequencingPCR，BSP)
亚硫酸氢盐修饰后测序法(BSP)Frommer等(1992)提出的研究DNA甲基化方法，此方法可靠性及 度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。用亚硫酸氢盐处理基因组
DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶， 对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化，称为BSP-直接测序法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。
特点: 度高，能够准确检测出甲基化的程度百分比。
DNA甲基化检测实验流程（亚硫酸氢盐法）多维度描述
1. 标准实验步骤式（按操作时序）
亚硫酸氢盐处理结合PCR检测甲基化流程：
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引物设计
根据目标基因的CpG岛序列，设计甲基化特异性引物（MSP）或亚硫酸氢盐测序引物（BSP），需覆盖关键甲基化位点，且引物序列中不包含CpG位点（避免甲基化状态影响扩增）。 -
DNA提取
从细胞、组织或血液样本中提取基因组DNA（gDNA），通过酚-氯仿法或柱提法纯化，测定浓度与纯度（OD260/280≈1.8），确保无RNA和蛋白质污染。 -
亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
- 将gDNA与亚硫酸氢钠溶液（终浓度3-4 mol/L）在50℃孵育4-16小时，使未甲基化的胞嘧啶（C）脱氨基转化为尿嘧啶（U），而甲基化胞嘧啶（5mC）保持不变；
- 加入NaOH终止反应并脱盐，获得“甲基化状态差异化修饰”的DNA模板。
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修饰后DNA纯化回收
通过乙醇沉淀或离心柱纯化去除残留亚硫酸氢盐和盐分，洗脱获得纯净的修饰后DNA，-20℃保存备用。 -
修饰后DNA用于PCR
以修饰后DNA为模板，使用设计好的引物进行PCR扩增：- 甲基化特异性PCR（MSP）：分别用甲基化引物（识别5mC）和非甲基化引物（识别U）扩增，通过有无扩增产物判断甲基化状态；
- 亚硫酸氢盐测序PCR（BSP）：扩增包含CpG岛的片段，产物用于克隆测序，直接读取甲基化位点比例。
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PCR产物的凝胶电泳检测扩增条带
取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察条带大小与亮度：- MSP法：甲基化引物组出现条带表明存在甲基化，非甲基化引物组条带表明未甲基化；
- BSP法：单一目标条带表明扩增成功，可用于后续测序分析。
2. 技术原理导向式（按核心操作分层）
甲基化检测核心逻辑：
- 样本预处理阶段：
DNA提取（获取gDNA）→ 亚硫酸氢盐修饰（C→U转化，5mC保留）→ 纯化回收（去除干扰物质） - 扩增与检测阶段：
引物设计（靶向CpG岛）→ PCR扩增（甲基化状态差异化扩增）→ 凝胶电泳（验证扩增有效性）
3. 符号简化流程图
� 引物设计 → � DNA提取 → � 亚硫酸氢盐修饰（C→U） ↓ � 修饰DNA纯化 → ⚡ PCR扩增 → � 凝胶电泳（条带检测） 4. 实验逻辑关系描述
以“甲基化状态的化学转化与分子区分”为核心，形成“修饰-扩增-验证”三阶流程：
- 修饰阶段：通过亚硫酸氢盐的化学作用，将“甲基化/未甲基化”的表观遗传差异转化为“C/U”的序列差异，为后续检测提供分子标记；
- 扩增阶段：利用引物对修饰后序列的特异性识别，实现甲基化与非甲基化模板的差异化扩增；
- 验证阶段：通过凝胶电泳快速判断扩增效率，为测序或定量分析奠定基础，最终实现从“表观遗传修饰”到“分子水平检测”的完整转化。
