IncRNA测序

简介

长链非编码RNA(longnoncodingRNA,IncRNA)是指长度在200~100000nt之间不具有蛋白编码功能的RNA分子。它们存在带polyA尾和不带polyA尾两种形式，具有跨物种的低保守性，组织特异性表达和丰度低等特点。IncRNA的种类远远超过编码RNA，保守估计哺乳动物基因组序列中4%~9%的序列产生IncRNA转录本，而相应的蛋白编码RNA的比例仅是1%~5%。目前研究提示IncRNA的功能机制主要包括参与转录调控、转录后调控、蛋白质运输和mRNA降解。IncRNA已经成为非编码RNA研究领域的一个热点，借助高通测序，研究人员能够快速获得与疾病或者特定生物学过程相关的IncRNA并进行深入研究。

实验流程解析

1. 起始材料与预处理

• 输入：总RNA（Total RNA）样本
• 关键处理：通过磁珠法或酶解法去除rRNA（核糖体RNA，占总RNA的80%-90%），保留mRNA及非编码RNA等有研究价值的转录本。

2. RNA片段化与反转录

• 片段化：将纯化后的RNA通过随机打断（如超声或金属离子处理）成约200-300bp的短片段
• 反转录：以RNA片段为模板，利用随机引物合成 条cDNA链，再通过DNA聚合酶合成双链cDNA（ds cDNA）

3. 文库构建核心步骤

• 末端修复：补平双链cDNA的黏性末端（末端补平）
• 加A尾：在3'端添加单碱基A，为接头连接做准备
• 接头连接：连接包含Index（样本标签）的测序接头
• PCR扩增：通过有限循环PCR（通常10-15 cycles）富集文库片段

4. 文库质控与测序

• 产出：构建完成的RNA-seq cDNA文库
• 质控（QC）：检测文库浓度、片段大小分布（主峰约300-500bp）及接头污染情况
• 测序平台：使用Illumina HiSeq 3000进行高通量测序（通常为双端150bp或250bp模式）

技术特点与应用

• 无偏性：随机打断策略可覆盖全转录组，避免引物偏好性
• 应用场景：基因表达量分析、差异表达基因筛选、可变剪切事件检测、新转录本发现等
• 平台优势：HiSeq 3000的高产出（单 flow cell可达600-1000 Gb）适合大规模转录组研究