简介

MeDIP-Seq(MethylatedDNAlmmunoprecipitationSequencing)测序是基于抗体宙集原理进行测序的全基因组甲基化检测技术，采用甲基化DNA免疫共沉淀技术，通过5"-甲基胞嘧啶(5mC)抗体特异性畜集基因组上发生甲基化的DNA片段，然后通过高通测序可以在全基因组水平上进行高精度的CpG密集的高甲基化区域研究。

hMeDIP-Seq(hydroxymethylcytosineDNAImmunoprecipitationSequencing)测序基于原理同MeDIP-Seq。利用5'-羟甲基胞嘧啶(5hmC)抗体特异性室集基因组上发生甲基化的DNA片段。5hmC是新发现的一种的修饰碱基，由10-11易位(TET)家族的酶通过氧化5mC产生的。5hmC不仅能够降低MeCP蛋白的甲基化结合结构域(MBD)与甲基化DNA的亲和性，具有潜在的参与基因表达调控的转录调节功能，而且参与了DNA去甲基化过程。

研究人员可以利用MeDIP-Seq和hMeDIP-Seq技术快速有效地寻找基因组上的甲基化区域，从而比较不同细胞、组织或疾病样本间的DNA甲基化修饰模式的差异，为生物学研究或临床应用方案提供理论证据,

实验设计概览

采用平行对照设计，分别针对两种关键DNA甲基化修饰（5-甲基胞嘧啶5mC和5-羟甲基胞嘧啶5hmC）进行富集测序，通过两组独立流程揭示表观遗传修饰特征。

流程一：5mC甲基化检测（MeDIP-seq）

1. DNA提取：从样本中分离高质量基因组DNA
2. 5mC抗体富集：使用特异性5mC抗体免疫沉淀含甲基化修饰的DNA片段
3. 文库构建：
   • 对富集片段进行PCR扩增
   • 构建MeDIP-seq DNA文库并通过QC（质量控制）
4. 测序与分析：
   • 采用HiSeq 3000平台进行高通量测序
   • 生物信息学分析（包括甲基化位点定位、富集区域分析等）

流程二：5hmC甲基化检测（hMeDIP-seq）

1. DNA提取：与流程一共享原始样本或独立提取
2. 5hmC抗体富集：使用5hmC特异性抗体捕获含羟甲基化修饰的DNA片段
3. 文库构建：
   • 对富集片段进行PCR扩增
   • 构建hMeDIP-seq DNA文库并通过QC
4. 测序与分析：
   • 同样使用HiSeq 3000平台测序
   • 独立进行生物信息学分析，重点解析5hmC修饰的基因组分布

技术特点与应用

• 对比优势：通过5mC和5hmC的平行检测，可区分两种甲基化修饰的功能差异（5mC通常与基因沉默相关，5hmC可能参与基因激活）
• 技术核心：依赖抗体的免疫沉淀（IP）技术，属于表观遗传学研究中的经典方法
• 应用场景：肿瘤表观遗传机制研究、发育调控、环境因素对基因表达的影响分析等

mRNA甲基化测序

简介

表观遗传修饰不仅发生在基因组层面(DNA甲基化)，同样在转录组层面也有表观修饰，并且其中重要的转录后调控功能。早在四十年前，人们就发现信使RNA上存在着腺嘌呤上的甲基化修饰(m6A)。这种m6A修饰非常普遍，出现频率大约是3-5个残基/mRNA。m6A甲基化修饰是可逆的，而且可能受到了动态调控。m6A的甲基化和去甲基化受到甲基化酶复合体METLE3，METLE14，WTAP和去甲基化酶FTO调控。m6A在人类和小鼠的转录组中非常保守，这说明这种修饰很可能具有重要的功能。m6A与mRNA剪切，生物钟调节，mRNA的稳定性相关。此外，m6A通过招芽YTHDF2诱导mRNA从翻译中的核糖体转移到细胞质的P-body，并在那里被降解。而且mRNA的降解程度与其甲基化位点数有关。

对于mRNA甲基化的检测，目前采用:甲基化mRNA室集并结合高通量测序(MeRIP-Seq,m6A-specificmethylatedRNAimmunoprecipitationwithnextgenerationsequencing)的方法。

MeRIP-Seq的原理是:由于在哺乳动物中mRNA甲基化一般发生在腺嘌呤的第6位氮原子上，所以可通过特异性结合m6A抗体富集高甲基化的mRNA片段，并结合 代高通量测序，对畜集到的mRNA片段进行测序，从而检测全转录组范围内的甲基化位点,

实验流程详解

1. m6A RNA富集

• 核心步骤：通过MeRIP（甲基化RNA免疫沉淀） 技术，使用m6A特异性抗体从总RNA中富集含N6-甲基腺苷修饰的mRNA片段。
• 原理：利用抗原-抗体特异性结合，捕获具有m6A修饰的RNA分子，实现甲基化转录本的分离。

2. 反转录与片段处理

• cDNA合成：将富集的m6A RNA反转录为双链cDNA。
• 末端修饰：
  • 平末端修复：补平cDNA片段的黏性末端，形成平末端。
  • 3'加A尾：在平末端3'端添加单个A碱基，为接头连接做准备。
  • 黏性末端转化：生成3'-dA突出末端，便于与带T尾的测序接头连接。

3. 文库构建与质控

• 接头连接：将带索引（Index）的测序接头连接到cDNA片段两端。
• PCR扩增：通过有限循环PCR（通常12-15 cycles）扩增文库，富集目标片段。
• 质量控制（QC）：检测文库浓度、片段大小分布（主峰约300-500bp）及接头污染情况，确保文库质量。

4. 高通量测序

• 测序平台：使用Illumina HiSeq 2500进行双端测序（通常为2×150bp模式）。
• 数据产出：根据实验需求，单样本测序数据量一般为10-20 Gb，以保证足够的测序深度覆盖m6A修饰位点。

技术特点与应用

• 特异性：依赖m6A抗体的高特异性，精准捕获甲基化修饰的RNA分子。
• 应用场景：mRNA甲基化修饰图谱绘制、差异甲基化位点筛选、甲基化与基因表达调控关联分析等。
• 平台优势：HiSeq 2500兼具高通量（单flow cell可达600 Gb）和高准确性，适合大规模表观转录组研究。