Tunel染色

Tunel染色即原位末端转移酶标记技术。凋亡细胞的DNA双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3’-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)作用下，将脱氧核糖核苷酸和生物索所形成的衍生物标记到DNA的3"末端，从而进行凋亡细胞的检测。TUNLE染色是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征,

技术原理

晚期凋亡细胞中染色体DNA双链或单链断裂产生粘性3"-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的催化下，将带有生物索(Biotin)分子的dUTP，标记到DNA的3'-末端，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的链酶亲和索Streptavidin(Streptavidin-HRP)结合， 通过DAB显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞，这就是Tunel(TdT-mediateddUTPNickEndLabeling)法检测细胞凋亡的原理。

TUNEL凋亡检测实验流程

一、样本预处理阶段

1. 脱蜡至水

   • 操作：与HE染色类似，通过二甲苯脱蜡→梯度乙醇（ →70%）→蒸馏水，将石蜡切片转为水合状态。
   • 目的：去除蜡质，使后续试剂能渗透组织细胞。

2. 蛋白酶K修复

   • 作用：用蛋白酶K（浓度通常20-30 μg/mL）消化组织蛋白，暴露断裂的DNA末端（约37℃孵育15-30分钟）。
   • 关键：避免过度消化导致组织形态破坏。

3. 破膜通透

   • 方法：使用0.1% Triton X-100（或柠檬酸盐缓冲液）处理切片，增加细胞膜通透性，使TUNEL反应液进入细胞。

二、TUNEL反应与信号放大

1. 孵育TUNEL反应液

   • 核心原理：末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）催化荧光素或生物素标记的dUTP连接到DNA断裂的3'-OH末端，标记凋亡细胞。
   • 孵育条件：37℃避光反应60分钟，PBS洗涤去除未结合的标记物。

2. 孵育POD反应液

   • 作用：若使用生物素标记的dUTP，需加入辣根过氧化物酶（POD）标记的链霉亲和素，通过抗原-抗体反应放大信号（37℃孵育30分钟）。

三、显色与结果观察

1. DAB显色

   • 底物反应：POD催化DAB（3,3'-二氨基联苯胺）显色，凋亡细胞的DNA断裂位点呈现棕褐色颗粒（细胞核或胞质内）。
   • 控制：显色时间通常3-10分钟，镜下观察至阳性信号清晰后用蒸馏水终止。

2. 苏木素染核

   • 对比染色：用苏木素复染细胞核（1-3分钟），使非凋亡细胞的细胞核呈蓝紫色，与棕褐色凋亡信号形成鲜明对比。

3. 脱水封片与镜检拍照

   • 脱水：梯度乙醇→二甲苯脱水后，中性树胶封片。
   • 观察：光学显微镜下计数棕褐色凋亡细胞（400×或1000×倍率），计算凋亡率。

技术特点与应用

• 特异性：精准标记DNA断裂，区分凋亡与坏死（坏死细胞无特征性DNA断裂）。
• 应用场景：肿瘤组织凋亡检测、药物诱导凋亡效果评估、发育生物学中的程序性细胞死亡研究。
• 关键质控：蛋白酶K浓度和孵育时间需优化；设立阳性对照（如DNase I处理样本）和阴性对照（不加TdT酶）。

注意事项

1、洗涤蛋白酶K时，一定要PBS冲洗3次，如果冲洗不净会严重干扰后续的标记反应;

2、3%的过氧化氢溶液孵育时间不应过长，否则会出现过氧化氢导致的DNA断裂，产生假阳性;

3、滴加Tunel检测液时，可利用防蒸发膜防止其蒸发影响样本的生物索标记;配制好的DAB显色液必须一次性使用完毕，不宜冻存。

常见问题

无/弱染色?

烤片温度过高，推荐56°℃-60℃1-2h

一抗是否适用固定液和石蜡切片，使用浓度是否过低，孵育是否时间过短等，

染色过深

染色试浓度过高或孵育时间过长;

显色剂浓度过高或孵育时间过长，

送样运输要求:

1、石蜡切片常温、组织由标准的石蜡包埋盒包理，石蜡与组织要均匀接合，不能有裂痕;蜡块厚度根据所需切片的数量而定，有效厚度至少要超过0.1cm。尽提供半年内的组织蜡块，超过半年的蜡块抗原可能丢失，做免疫组化可能出现检测不到蛋白。

2、冰冻切片-20℃、固定后细胞爬片4℃。