免疫荧光染色

用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法;用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞(或组织)化学技术。该技术的主要特点是:特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是:非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。国外生产的TDM用试剂盒，有相当一部分即属于此类，并且还有 TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。

技术原理

免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色索标记在抗体(或抗原)上，与其相应的抗原(或抗体)结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

免疫荧光染色实验流程

一、样本预处理

1. 脱片、二甲苯脱蜡

   • 操作：将贴附于载玻片的石蜡切片分离（脱片），经二甲苯浸泡脱蜡（2次，每次5-10分钟），去除蜡质。
   • 注意：若为细胞爬片或冰冻切片，可跳过此步骤直接进入水化。

2. 梯度酒精水化

   • 操作：依次通过 →95%→70%梯度乙醇各1-2分钟， 用蒸馏水洗涤，使切片从脱水状态转为水合状态，便于抗体渗透。

3. 滴加pH7.4的PBS于标本上，使标本保持一定湿度

   • 作用：用磷酸缓冲盐溶液（PBS）湿润样本，防止后续操作中组织干涸，同时维持生理pH环境。

二、抗原修复与封闭（隐含步骤）

• 推测步骤：根据流程逻辑，此阶段可能省略了抗原修复（如柠檬酸盐缓冲液热修复）和封闭（如5% BSA阻断非特异性结合）步骤，实际操作中需根据抗原特性补充。

三、抗体孵育与洗涤

1. 滴加稀释荧光标记抗体溶液使其覆盖标本，保温

   • 核心步骤：加入荧光基团（如FITC、Cy3）标记的一抗或二抗，37℃孵育1-2小时（或4℃过夜），使抗体与目标抗原特异性结合。
   • 关键：抗体需用PBS按说明书比例稀释，确保覆盖整个标本区域。

2. 取材玻片，用滤纸吸去多余水分

   • 操作：孵育后倾斜玻片，用滤纸轻轻吸去边缘多余液体，避免直接擦拭标本导致组织脱落。

3. 0.01mol/L, pH7.4的PBS冲洗，不时震荡

   • 洗涤：用PBS洗涤3次，每次5分钟并轻微震荡， 去除未结合的游离抗体，降低背景荧光。

四、封片与荧光检测

1. 取出玻片，置于玻片架上

   • 准备：洗涤后将玻片垂直放置于玻片架，沥干多余液体。

2. 加一滴缓冲甘油，盖玻片覆盖

   • 封片：滴加抗荧光淬灭剂（含缓冲甘油），缓慢覆盖盖玻片（避免气泡），防止荧光信号快速衰减。

3. 荧光显微镜观察标本的特异性荧光强度

   • 检测：根据荧光标记物选择对应激发波长（如FITC用488nm，Cy3用550nm），在荧光显微镜下观察抗原的定位（绿色/红色荧光）及表达强度。

技术特点与应用

• 高特异性：通过抗原-抗体特异性结合，精准定位目标蛋白在细胞/组织中的分布。
• 多色标记：可同时使用不同荧光标记的抗体，实现多种抗原的共定位分析。
• 应用场景：肿瘤标志物检测、细胞骨架蛋白定位、免疫细胞浸润分析等。
• 关键质控：需设置阴性对照（不加一抗）排除非特异性荧光，阳性对照验证抗体有效性。

送样运输要求:

1.冰冻切片-20C保存和运输;

2.石蜡切片常温运输至实验室;

3.细胞爬片用固定液浸泡，4C保存和运输。