番红-固绿染色

番红-固绿染色(软骨)在涉及关节软骨及软骨下骨的形态学研究中，常需联合使用多种染料以显示其组织学结构。其中，起源于上世纪60年代的番红O(safraninO)-固绿(fast green)染色因可以直观反映关节软骨、软骨下骨和骨组织的结构而备受青睐。软骨呈红色，成骨呈绿色。

技术原理

番红-固绿(软骨)染色法的染色原理在于赌碱性的软骨和碱性染料番红O结合呈现红色，赌酸性的骨和酸性染料固绿结合而成绿色或者蓝色，与呈现红色的软骨对比鲜明，从而将软骨组织和骨组织区分开。番红O是一种结合多阴离子的阳离子染料，其显示软骨组织是基于阳离子染料与多糖中阴离子基团(硫酸软骨索或硫酸角质索)结合。番红O着色与阴离子的浓度近似成正比关系，间接反映基质中蛋白多糖的含量和分布。当软骨收到损伤时，软骨中的糖蛋白会释放出来，使基质成分分布不均匀，从而导致番红O淡染或不着色。通过图像分析软件可以对番红O染色的软骨基质进行定是分析。固绿与胶原纤维结合，不宜褪色，

番红-固绿复染实验流程

1. 脱蜡至水

• 标准操作：石蜡切片经二甲苯脱蜡（2次，每次5-10分钟）→ 梯度乙醇（ →95%→70%）各1-2分钟→ 蒸馏水洗涤，使切片完全水合。
• 关键作用：去除蜡质，为染料渗透组织奠定基础。

2. 固绿染色

• 染料特性：固绿（Fast Green）是一种酸性染料，可与组织中的碱性成分（如胶原纤维、细胞质）结合，在软骨组织染色中通常使软骨基质或纤维成分呈绿色。
• 染色条件：切片浸入0.1%固绿染液（常用冰醋酸水溶液配制，pH 2.0-3.0）中染色5-10分钟，之后用蒸馏水快速漂洗。

3. 番红染色

• 染料特性：番红O（Safranin-O）是碱性染料，对酸性黏多糖（如软骨基质中的糖胺聚糖）亲和力强，在软骨组织中使软骨细胞及软骨陷窝呈红色，与固绿的绿色背景形成鲜明对比。
• 染色条件：切片浸入0.5%番红O染液中染色10-15分钟，蒸馏水洗涤去除 excess 染料。

4. 脱水封片

• 操作：经95%乙醇→ 乙醇脱水（各1-2分钟）→ 二甲苯透明（2次，每次5分钟）→ 中性树胶封片。
• 注意事项：番红为水溶性染料，脱水过程需快速，避免颜色洗脱。

5. 显微镜镜检

• 观察结果：软骨细胞/陷窝呈红色，软骨基质或胶原纤维呈绿色，适用于关节软骨损伤修复、骨关节炎病理分析或植物组织木质部与韧皮部的区分。

技术特点与应用

• 组织特异性：尤其适用于软骨组织染色，能清晰显示软骨细胞、基质及钙化区域的结构差异。
• 染色机制：利用染料的酸碱性差异实现双染，番红（碱性）优先结合酸性基质，固绿（酸性）标记碱性结构。
• 拓展应用：在植物学中可区分木质化细胞（番红着色）与非木质化组织（固绿着色）。

注意事项

1、注意固绿的上色程度，番红不要掩盖绿色。

2、切片分化时间应恰当，以背景呈绿色为宜。分化过度容易导致切片不着色，分化不足容易导致切片着色过深。

送样运输要求:

1、植物样本置于20倍样本体积的FAA固定液中固定24h以上，常温运输送样。

2、切勿冷冻结冰。