技术原理

免疫组化，是应用免疫学基本原理一一抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酸、金属离子、同位索)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

免疫组化SP法实验流程

一、样本预处理阶段

1. 切片脱蜡至水

   • 操作：石蜡切片经二甲苯脱蜡（2次，每次5-10分钟）→ 梯度乙醇（ →95%→70%）各1-2分钟→ 蒸馏水洗涤2次，使切片完全水合。
   • 目的：去除蜡质屏障，确保后续试剂能渗透组织。

2. 抗原修复

   • 常用方法：
     • 热修复：将切片浸入柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中，微波炉加热至沸腾后保温10-15分钟，自然冷却至室温。
     • 酶修复：用蛋白酶K（20-30 μg/mL）37℃孵育15-30分钟（适用于胞质或细胞表面抗原）。
   • 作用：暴露被甲醛固定掩盖的抗原表位，增强抗体结合效率。

3. 3%的双氧水处理+阻断血清封闭

   • 双氧水处理：滴加3% H₂O₂溶液室温孵育10-15分钟，灭活内源性过氧化物酶（避免DAB显色背景干扰）。
   • 血清封闭：用5%-10%正常山羊/兔血清（与二抗来源一致）室温封闭30分钟，阻断抗体与组织非特异性位点的结合。

二、抗体孵育与信号放大

1. 一抗4℃过夜孵育

   • 操作：滴加按比例稀释的特异性一抗（用PBS或抗体稀释液稀释，浓度通常1:100-1:500），4℃湿盒内孵育过夜（或37℃孵育1-2小时）。
   • 关键：一抗需针对目标抗原（如Ki-67、CD34），孵育期间保持切片湿润，避免抗体干涸。

2. 二抗室温孵育

   • 操作：PBS洗涤3次（每次5分钟）后，滴加生物素标记的二抗（或SP法中的聚合物二抗），室温孵育30-60分钟。
   • 作用：二抗与一抗特异性结合，通过生物素-亲和素系统或聚合物酶复合物放大信号（SP法即 streptavidin-peroxidase 复合物法）。

三、显色与对比染色

1. 显色

   • 底物反应：滴加DAB显色液（3,3'-二氨基联苯胺），室温孵育3-10分钟，镜下观察至阳性信号（棕褐色颗粒）清晰后，用蒸馏水终止反应。
   • 结果特征：目标抗原表达部位呈棕褐色，背景无色或浅黄。

2. 苏木素染核+脱水透明

   • 核染色：用苏木素染液复染细胞核30秒-1分钟，使细胞核呈蓝紫色，与棕褐色阳性信号形成对比。
   • 分化与返蓝：1%盐酸乙醇分化数秒→自来水返蓝2分钟→梯度乙醇（70%→95%→ ）脱水→二甲苯透明。

四、封片与镜检

1. 封片并显微镜镜检
   • 封片：滴加中性树胶，覆盖盖玻片，轻压去除气泡，室温晾干。
   • 观察：光学显微镜下观察阳性信号的定位（胞核/胞质/胞膜）和表达强度，常用于肿瘤标志物检测、病理诊断等。

技术特点与应用

• 特异性：通过一抗-二抗的级联放大，实现低丰度抗原的高灵敏度检测。
• SP法优势：采用聚合物酶复合物标记二抗，避免内源性生物素干扰，背景更低，信号更强。
• 临床应用：乳腺癌HER2检测、Ki-67增殖指数评估、免疫细胞（如CD3、CD20）浸润分析等。
• 关键质控：设置阳性对照（已知阳性组织）和阴性对照（PBS代替一抗），确保结果可靠性。

送样运输要求

1、石蜡切片制片，组织取样后应立即放入固定液中，避免冻存

2、冰冻切片制片应取用新鲜组织，以免抗原丢失;

3、组织蜡块可以保存很长时间，但是石蜡切片理论上不能超过半年。冰冻切片不能超过3个月。

注意事项

1.苏木索复染时间需要摸索，尤其阳性染色也在细胞核上

2.DAB显色时间需要达到优化，镜下观察达到阳性染色明显但背景不太深。

3.抗体孵育时间和抗体浓度需要摸索。尤其一抗孵育好在4度过夜

4.切片脱蜡和水化要充分;加反应液时要要盖组织充分;每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片;用组化笔画圈时尽画大一点，否则墨水排斥液体，引起片周边干片。