尼氏染色

尼氏染色发明于1892年，是根据它的发明人德国科学家FranzNissl命名的。细胞的DNA和RNA带负电荷，这是因为它们分别是脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸组成。以脱氧核糖核苷为例，它由碱基、脱氧核糖和磷酸构成。其中的磷酸使DNA和RNA带负电荷、呈酸性。尼式染色正是利用了DNA、RNA酸性的特征，用碱性的染料(比如，甲酚紫、甲苯胺蓝)去绑定DNA和RNA，从而将细胞着色。尼氏染色的部位主要是DNA聚集的细胞核，内质网，特别是粗面内质网，其上的核糖体包含的核糖体RNA占细胞RNA总的80%以上。粗面内质网也因为是尼氏染色显著的染色位点而被称为尼氏体。

技术原理

神经元细胞体包括一个具有皱褶核膜的大细胞核、稀疏的染色质和一个明显的核仁。在细胞体中细胞质是尼氏颗粒，即能够代表粗面内质网并在很多神经元中产生特异的斑点状嗜碱性表现的嗜碱性颗粒。尼氏颗粒可以用很多染色来显示如中性红、亚甲基蓝、甲苯胺蓝和甲基紫等。染色的变异、pH和分化的时间使一些染色既可以仅突出尼氏物质，也可以显示神经元的细胞核和神经胶质。各种神经细胞内都含有尼氏体，但其形状、数、分布位置常常不同。尼氏体也存在于树突中，但不在于轴突和胞体的轴丘。尼氏体会因为生理状态的变化而变化，尼氏体是神经元内合成蛋白质合成的重要部位，当神经元受到刺激后，胞体内的尼氏体会明显减少。通常尼氏体能被碱性染料如硫革、亚甲蓝、甲苯胺蓝和焦油紫等染料染成紫蓝色。

尼氏染色实验流程

1. 脱蜡至水

• 操作：石蜡切片经二甲苯脱蜡（2次，每次5-10分钟）→ 梯度乙醇（ →95%→70%）各1-2分钟→ 蒸馏水洗涤2次，使切片完全水合。
• 关键：神经组织切片较脆弱，脱蜡过程需避免剧烈震荡，防止组织脱落。

2. 1%甲苯胺蓝（焦油紫）染色

• 染料选择：尼氏染色常用甲苯胺蓝或焦油紫（Cresyl Violet），两者均为碱性染料，可与尼氏小体中的核糖核蛋白（rRNA） 特异性结合。
• 染色条件：
  • 切片浸入1%甲苯胺蓝水溶液（pH 3.0-4.0，可加0.1%冰醋酸增强染色特异性）中，室温染色10-20分钟。
  • 若使用焦油紫，需60℃温育染色5-10分钟，染色更深且背景更低。
• 分化步骤（可选）：用70%乙醇快速分化数秒，直至胞核与尼氏小体清晰，背景呈淡蓝色。

3. 乙醇脱水-二甲苯透明

• 脱水：依次通过95%乙醇→ 乙醇各1-2分钟，快速去除水分（避免染料洗脱）。
• 透明：二甲苯浸泡2次，每次5分钟，使组织切片透明，便于显微镜观察。

4. 中性树胶封片

• 操作：滴加中性树胶，覆盖盖玻片，轻压去除气泡，室温晾干后镜检。

染色结果与技术特点

• 典型结果：

  • 尼氏小体：神经元胞质内呈蓝紫色颗粒状（粗面内质网和核糖体的复合体），是神经元合成蛋白质的主要场所。
  • 细胞核：神经元核仁清晰，呈深蓝色，与胞质颗粒形成鲜明对比。
  • 背景：神经胶质细胞和髓鞘呈淡蓝色或无色。

• 核心应用：

  • 观察神经元形态（如胞体大小、突起数量）及尼氏小体的分布与变化（如神经损伤后尼氏小体溶解）。
  • 神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）的神经元病理变化研究。

• 技术优势：

  • 操作简单，无需抗原修复或抗体孵育，适合神经组织的常规形态学分析。
  • 染色稳定性高，切片可长期保存。

关键注意事项

• 甲苯胺蓝染色时间需根据组织类型调整（如大鼠脑切片通常15分钟，人脑组织需延长至20分钟）。
• 分化步骤是关键：过度分化会导致尼氏小体脱色，分化不足则背景过深，需镜下实时观察控制。
• 焦油紫染色效果更特异（尼氏小体呈紫红色），但成本高于甲苯胺蓝，可根据实验需求选择。